Monday, October 17, 2011

Analytical Technologies: Cell Flow Cytometry & FACS

Ich finde es ist mal wieder Zeit für einen "wissenschaftlichen" *husthust* Post :D
Dieses Semester hatten wir ein sehr interessantes Fach (hatten, weil sowohl Prüfung als auch Labor schon abgeschlossen sind), wo wir sehr viele Analyse-Verfahren und Methoden besprochen haben und lernen wie solche spannenden Dinge wie confocal laser microscopy oder Massenspektrometrie funktionieren.

Allerdings wird in dem Kurs nur auf die "Grundlagen" wert gelegt, das heißt man muss nicht bis ins kleinste Detail wissen wie so ein Gerät nun funktioniert, aber man solle eben verstanden haben worum es geht =)
Obwohl viele Leute darüber fluchen finde ich das Fach einfach großartig, weil es auch ein bisschen mit Physik zu tun hat XD und ich finde es einfach großartig was für geniale Methoden zur Analyse es so gibt!

Eine davon, die "Cell Flow Cytometry" will ich euch hier vorstellen und einen kleinen EInblick geben wie das funktioniert - allerdings, so wie immer bei Content der mit meinem "Fach" zu tun hat, auf Englisch, da mit das einfach leichter fällt X'D
Hoffe also ihr seid mir nicht böse dass der Post ab hier in Englisch verfasst ist ^_^"


To understand Cell Flow Cytometry, it is not ultimately necessary to understand how and why fluorescence works - however, I think it's quite a good opportunity to look at that topic too.
But don't worry, we won't get too deeply involved in the physics part.

All you should know is a quite simple principle.
Visible light (light of the visible spectrum) is an electromagentic wave.
If light hits an atom that is fluorescent, it can excite an electron of that atom, and move it to a state of higher energy. In this state, the whole atom is a little bit unstable, and you can imagine that this is not a very favourable situation for the atom, therefore the electron will sooner or later "drop" back on his original energy level, his original state of energy.
But as we all (hopefully? XD) know, energy cannot be simply "lost", so what happens with the energy that the electron took up when it was excited?
The electron itself will emit an electromagentic wave and thus produce light!
This is what fluorescence is all about.
However, it is worth noticing that the emitted light is always of lower energy than the light that excited the electron. Sounds logical, doesn't it? You can imagine some of the energy being used up for "moving" the electron from the lower state to the higher energy state. The remaining energy is released as light when it falls back.
Lower energy basically means a higher wavelength (imagine you slap a person, and everytime you slap is a "wave". The longer the time between the slaps, thus the longer the "wave", the less the person will be hurt. I always find hitting people to be a good method to remember things ;D ), and this also means that the light that is emitted will have a different "color" then the one that was absorbed.

So now that we know that I want to show you a very cool technique to count cells in a sample - and it's also very simple to understand!

So how does this method work?
On the picture to the rigth you can see something like a long and small capillary. Via a special technique, the cells are forced through this capillary individually, this means only one cell passes the capillary at a time.
At some point there is an optical window. This means that a laser beam hits the sample in the capillary!
In order to make the different cells distinguishable from each other, you have to prepare different fluorescent markers (fluorescent dyes), for example you have a red dye that binds to a cell of type "A" and a green dye that binds to cell "B". For the third cell type, let's call it "C", we don't need a dye. You will soon see why.

As soon as a cell of type A or B passes the optical window, the laser beam will excite the fluorescence dye molecule on that cell. The dye will emit light of a specific spectrum, which you can measure - by determining the wavelength (i.e. the color of the light) you can now easily distinguish between a cell A or a cell B!
So what if it were a cell of type C? Then you wouldn't get any emission signal, and again would now that the cell that has just passed the optical window is of Type C.

In a medical application your question could for example be: What is the ratio between B- and T-cells in my patient's blood? Both these cell types are part of the immune system and in a healthy human this ratio is a relatively fixed number. However, you probably can immediately think of a disease that affects the immune system, in particular human T-cells : an infection with the HIV virus.
The virus invades T-cells and destroys them from within, therefore compromising the immune system of the patient.
If you apply a drug therapy against the virus, you could use the Cell Flow Cytometry to monitor the number of T-cells, and you could see if the number would remain stable (meaning the drug works) or if the number drops.


So try to guess now, what else we could use that method for. Is it just counting and thus quantification of cells in a sample?
Of course not!
Consider the schematic picture on the rigth. The process that is illustrated there is called Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).
In this case, our fluorescent dyes need to have a charge. After passing the optical window, a scanner detects the color of the sample and consequently adjusts an electrical field through which the cell then passes. If the cell is, for example, green it shall  be deflected to the left (see picture). In order to achieve this, a positive charge is applied to the drop that contains the cell as soon as it leaves the optical window. Cells with red dye will get a negative charge and be deflected to the right and cells with no charge will not be deflected at all. This deflection allows a separation of the different cell types, and you can collect the fractions below.
The effectiveness of this procedure is not exactly 100%, so you have to perform further sorting steps with the fractions, in order to achieve a higher purity of your sample


So, that's basically it ^^
If you've read through all of this... you probably understand now at least the principle of fluorescence and one type of application!
I don't know if you can understand my fascination for this topic and if it's even remotely interesting for you XD
Anyway, just let me know if this type of stuff is interesting to you, because I'd love to tell you more :3

I hope you enjoyed this small abstract of my studies!

5 comments:

  1. Ich liebe deine "Wissenschaftspost"! :D
    Wiedermal sehr interessant.. kannte diese Technik noch nicht. Ich werde dieses Semester mich entweder mit HPLC, GC-MS oder GCxGC beschäftigen. Für mich noch Bücher mit sieben Siegeln, wiel cih vorher noch keinen Kontakt damit hatte, aber cih freu mich jetzt schon auf die Geräte.. ^^"

    Welche Verfahren habt ihr in der vorlesung kennen gelernt?

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  2. Ach ja, find ich gut :D wir hatten letztes Jahr nen Spektroskopiekurs, wo wir gelernt haben, was IR-, MS-, H-NMR-, C-NMR- und UV/Vis-Spektren sind und wie man die auswertet. Ist schon echt interessant, was son paar Striche einem sagen können. Im OC-Grundpraktikum hatten wir ein IR-Messgerät, was wir selber bedienen durften. Auch wenn die Spektren nicht viel aussagten... das NMR-Messgerät ist da schon wesentlich beeindruckender! [Und wir durften uns das nur anschauen, anfassen nicht...] Und GC-MS war auch irgendwie interessant, dort durften wir tatsächlich unsere Probe selbst einspritzen ^^
    Und manches mal haben mich die Spektren echt um den Verstand gebracht :/

    Mit dem, was du hier beschreibst, werde ich vermutlich zwar nicht zu tun haben, aber es klingt dennoch interessant! Mehr von sowas bitte :D

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  3. Spannend! Und ich find es voll beeindruckend, dass man sowas eher auf Englisch als auf Deutsch schreibt ^^ Ich kann zwar genug Englisch, dass ich so einen text ohne größere Anstrengungen lesen kann, aber selbst schreiben ist schon was anderes...wobei, ist wahrscheinlich auch Gewohnheits- bzw. Übungssache :D?
    Ich studiere übrigens nun sowas ähnliches wie du :) daher ist es gleich doppelt spannend für mich :)

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  4. @Álfi: Ohhh, über HPLC haben wir auch gelernt :D Aber nur oberflächlich, haben eher so die prinzipien der Liquid Chromatography gesprochen ^^ Überhaupt haben wir bis jetzt erst zweimal mit Chromatographie gearbeitet, einmal "Size Exclusion Chromatography"... war echt witzig zu sehen wie sich die bunten Phasen da in der Säule auftrennen XD
    Wir haben viele Methoden durchbesprochen die mit Spectrometrie zu tun haben, hauptsächlich so Fluorescence-Spectroscopy ^^ Da fällt dann nämlich auch ELISA und QPCR drunter. Überhaupt finde ich Fluorescence-based assays total toll :D

    @Feralia: NMR musste ich gerade googeln weil ich das noch gar nicht kannte. o.o Woaaah, das klingt auf jeden Fall toll und spannend!!
    Aber trotzdem werd ich nicht unbedingt viel mit diesen Geräten zu tun haben, da ich später eher mit Zellkulturen als Proteinen arbeiten will XD
    Aber ich finde es immer cool, die physikalischen Grundlagen der Geräte zu kennen und freue mich natürlich auch, wenn sich noch jemand dafür interessiert ^^

    @Leeri: Für mich ist es viel viel leichter sowas auf Englisch zu schreiben, da ich ja auch alles auf Englisch gelernt habe XD Aber ja, Übung und Gewohnheit spielen da schon eine Rolle denke, ich.
    Für mich ist es halt so, dass ich manchmal sogar auf Englisch denke oder träume. Da mein Umfeld ständig immer wieder zwischen Englisch- und Deutschsprachig wechselt bin ich mittlerweile an einem Punkt wo mir beides eigentlich gleich leicht fällt, fast sogar Englisch leichter. Nicht nur wenns um Uni-Kram geht, sondern auch im Alltag fallen mir oft sachen nur auf Englisch ein oder ich denke mir was auf Englisch oder ärgere mich auf Englisch usw.... XDDD
    Wie genau heißt denn dein Studiengang? :D

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  5. Mein Studiengang heißt "Molekulare Biotechnologie" :) deiner auch oder? Ich meinte mit "ähnlich" nur, dass jede Uni/FH da irgendwie ihren eigenen Schwerpunkt setzt, was Fächer und so angeht :D

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